基于网络药理学和分子对接技术的万应胶囊治疗急性上呼吸道感染伴发热作用机制研究

急性上呼吸道感染是呼吸系统炎症的总称，占综合医院门诊患者的20%~40%和住院患者的12%~35%［1］。上呼吸道感染包括鼻咽炎、咽炎、扁桃体炎和中耳炎等一系列影响上呼吸道的急性疾病［2］。绝大多数急性上呼吸道感染是由病毒引起，据报道有200 多种病毒可引起上呼吸道感染［3］。目前治疗主要以抗病毒药物为主，解热镇痛和抗组胺药等为辅［4］。万应胶囊出自于经典名方万应锭，主要由黄连、胡黄连及冰片等9 味中药组成，其中黄连清热凉血，儿茶清肺化痰，熊胆、牛黄息风止痉、化痰开窍，再配合其他药物，共奏清热镇惊、化痰开窍之功。有研究表明，万应胶囊治疗小儿上呼吸道感染的总有效率为90%［5］。虽然万应胶囊治疗上呼吸道感染具有较好的临床疗效，但其作用机制尚不明确，缺乏理论依据。网络药理学可用于研究药物、成分、靶点及疾病之间的相互作用，分子对接技术可虚拟筛选药物靶点及预测药效成分。中药复方所含化学成分复杂，难以阐明其药理作用，网络药理学讲究整体性，可阐明中药复方的作用机制，主要应用于药理学、生物化学与分子生物学等领域。本研究采用网络药理学和分子对接技术研究万应胶囊治疗急性上呼吸道感染伴发热的作用机制，以期为进一步的实验研究和临床应用提供理论基础。

资料与方法

1. 1　筛选万应胶囊潜在活性成分

以万应胶囊中的胡黄连、黄连、儿茶、冰片、熊胆粉、人工麝香及牛黄7 味药为关键词，在中药系统药理学数据库与分析平台［6］（Traditional Chinese Medi⁃cine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）、草药成分和靶标数据库［7］（HerbalIngredients Targets Platform，HIT）及本草组鉴数据库［8］（HERB）中检索中药潜在活性化合物与潜在靶点，根据口服生物利用度（oral bioailability，OB）≥30% 且类药性（drug likeness，DL）≥0. 18 为标准［9］筛选出药物的潜在活性成分。

1. 2　预测活性成分靶点基因

通过PubChem 数据库获得万应胶囊活性成分的简化分子线性输入规范式（simplified molecular inputline entry specification，SMILES），输入至Swiss TargetPrediction数据库［10］中检索潜在靶点，删除重复靶点后，获得万应胶囊中潜在活性成分的作用靶点。

1. 3　获取疾病相关靶点

在GeneCards 数据库［11］、OMIM 数据库及Dis⁃GeNET 疾病数据库［12］中以“acute upper respiratoryinfection accompanied with fever”为关键词筛选与其相关的疾病靶点，删除重复和无效基因名称后，获得疾病靶点。

1. 4　构建蛋白质-蛋白质相互作用网络图

将药物的潜在靶点和疾病的相关靶点进行映射，采用 TBtools 软件绘制韦恩图，获得万应胶囊治疗急性上呼吸道感染伴发热的潜在作用靶点。将交集基因靶点输入至STRING平台获取蛋白相互作用关系，构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein inter⁃action，PPI）网络［13］，并以 Cytoscape 软件进行可视化［14］。通过Cytoscape软件的 CytoNCA 插件进行网络拓扑计算，并以中介中心性（betweenness）为筛选标准获得排名前10 的关键靶点。通过Metascape 数据库［15］对核心靶点进行模块分析，筛选模块中度中心性（degree centrality）靠前的关键靶点。

1. 5GO 功能及KEGG 通路富集分析

通过R 软件对核心靶点进行GO 功能及KEGG 通路富集分析，从分子功能、细胞组分、生物过程3 个角度获得有关信号通路及生物进程并进行可视化分析。同时，将获得的关键通路和核心靶点进行联合分析，构建“中药-活性成分-靶点-通路-疾病”网络图。

1. 6　分子对接

使用 RCSB PDB 数据库检索和下载关键靶蛋白的三维立体结构文件［16］，同时利用 PubChem 数据库下载活性化合物的三维立体结构文件。在对接之前，配体和受体需要使能量最小化，删除受体的水分子（PDB文件），添加极性氢原子，赋予电荷并添加磁场。通过将活性化合物与受体蛋白分子对接，使用AutodockVinahe 和Autodock 分子对接软件分别评价与验证网络药理学筛选结果。

 结果

2. 1　万应胶囊活性成分的筛选和靶点预测

从TCMSP 数据库中收集潜在活性化合物共计179 种，分别从HIT 与HERB 数据库中收集66 种与252 种。根据药动学参数从上述数据库中分别筛选出有效活性成分42、2 及32 种，去重后共计51 种。通过PubChem 和SwissTargetPrediction数据库预测万应胶囊潜在活性化合物靶点，去重后共筛选707个。以acute upper respiratory infection accompanied with fever为关键词，检索GeneCards、OMIM、Dis⁃GeNET 疾病数据库，分别检索出疾病靶点951 个、231 个及78 个，从GeneCards 数据库中筛选相关性评分（relevance score）>10 的靶点669 个，从DisGeN⁃ET 数据库中筛选相关性评分≥0. 1 的靶点2 个。将上述 3 个数据库中筛选的靶点去重后获得疾病靶点共754 个。万应胶囊活性成分靶点和急性上呼吸道感染伴发热的疾病相关靶点交集后，获得潜在基因123 个。

2. 2　蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建和关键靶点的筛选

将共同靶点输入STRING 数据平台，对获得的PPI 网络进行拓扑结构分析，Cytoscape 软件网络拓扑参数计算结果显示，中介中心性值排名前10 的基因包括STAT3、PIK3R1、PTPN11、SRC、HRAS、PIK3CA、CINNB1、AKT1、JUN、STAT1，可能是万应胶囊治疗急性上呼吸道感染伴发热的重要潜在药效活性成分，圆圈越大，中介中心性值越大，见图1。

2. 3　模块分析

模块分析结果涉及5 个模块的 60 个靶点可能发挥重要的作用。每个模块对应特定的生物学功能。其中，模块1 涉及蛋白酪氨酸激酶的活性，模块2 涉及转录因子结合，模块3涉及DNA结合转录因子结合，模块4涉及肾素-血管紧张素系统，模块5涉及肽酶活性。根据中介中心性与度中心性进行排序，将STAT3、HRAS、SRC、PIK3R1、PTPN11 鉴定为万应胶囊治疗急性上呼吸道感染伴发热的关键靶点，见图2。

2. 4GO 功能及KEGG 通路富集分析

GO 功能富集分析显著性前10 的结果显示，生物过程显著富集于肽基-酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修饰、白细胞迁移、细胞对化学应激的反应等。细胞组分显著富集于膜筏、膜微域、囊泡腔、细胞质囊泡等。分子功能显著富集于蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、非膜跨越蛋白酪氨酸激酶活性等，见图3。

KEGG 通路富集分析显著性前20 的包括前列腺癌、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药性、癌症中心碳代谢、Kaposi 肉瘤相关疱疹病毒感染、乙型肝炎、HIF-1 信号通路、糖尿病并发症中的AGERAGE信号通路、脂质和动脉粥样硬化、癌症中的蛋白聚糖、PD-L1 表达和PD-1 检查点通路在癌症中的应用等，见图4。

2. 5　构建“中药-活性成分-靶点-通路-疾病”网络图

将万应胶囊治疗急性上呼吸道感染伴发热的药物活性成分、关键靶点及关键通路进行联合分析，采用Cytoscape 构建万应胶囊治疗急性上呼吸道感染伴发热的“中药-活性成分-靶点-通路-疾病”网络图，可见万应胶囊的25 种药物活性成分通过5 个关键靶点及15 个关键信号通路治疗急性上呼吸道感染伴发热，见图5。

2. 6　分子对接

将STAT3、HRAS 与万应胶囊的药物活性成分进行分子对接，结果显示，万应胶囊中与STAT3、HRAS具有一定结合活性的活性成分分别有3 种和4 种，见表1。其中，STAT3 与arveninⅠ的结合能最强，HRAS与6-阿魏酰梓醇的结合能最强，见图6 和图7。因此，arveninⅠ和6-阿魏酰梓醇可能是万应胶囊治疗急性上呼吸道感染伴发热的潜在活性化合物。

 讨论

万应胶囊出自于中医名方万应锭，具有清热镇惊、化痰开窍之功效。现代药效学研究也证实其具有解热、抗炎、抗菌及抗病毒作用［17-19］。中医将上呼吸道感染归为感冒、咳嗽的医学范畴。上呼吸道感染体征有发热、咽部充血及扁桃体肿大等。有研究表明，呼吸道感染大部分为病毒感染所致，如肠道病毒、腺病毒等［20］。万应胶囊治疗上呼吸道感染的临床功效显著，但其作用机制尚不明确，制约其科学临床应用及现代化发展。本研究筛出STAT3、HRAS、SRC、PIK3R1及PTPN11为万应胶囊治疗上呼吸道感染伴发热的关键靶点，其多数与炎症反应有关［21］。STAT3 的磷酸化会促进炎症细胞因子的产生和释放，同时其对T 淋巴细胞产生免疫抑制，是JAK2/STAT3 信号通路中的一个关键蛋白，有实验验证，抑制STAT3 的磷酸化可减轻蝮蛇咬伤大鼠的肝脏炎症反应［22］。HRAS 作为细胞膜上重要的信号转导分子，可间接激活丝裂原活化蛋白激酶等与炎症相关的信号通路，从而导致炎症发生［23］。PI3K/AKT 信号通路是参与调控机体细胞增值、凋亡的重要信号通路，PIK3R1 可负调控PI3K/AKT 的激活，抑制PIK3R1表达，增强PI3K 和AKT 的磷酸化，进而促进炎症反应发生发展［24］。PTPN11 作为JAK/STAT 信号通路的重要组成基因之一，在调节吞噬细胞生长、分化、凋亡方面起着至关重要的作用［25］，JAK/STAT 通路可以刺激巨噬细胞的凋亡并抑制炎症反应的发生。KEGG 富集分析结果显示，万应胶囊治疗急性上呼吸道感染伴发热的重要通路包括乙型肝炎、HIF-1、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 等信号通路。C 型凝集素受体可识别病原体和内源性危险信号，通过识别病毒的病原体相关分子模式而启动免疫反应，进而激活防御机制，抵抗病毒感染［26］，由此推断万应胶囊可能通过增强机体识别病原微生物的能力，及时启动免疫反应，进而治疗上呼吸道感染。PI3K-Akt 信号通路参与多种生理过程，如细胞生长、增殖、运动和代谢等［27］，还可能与多种类型细胞的炎症反应与癌变息息相关［28］。上呼吸道感染诱导免疫细胞凋亡，导致凋亡蛋白酶增多，与PI3K 的催化亚基或调节亚基结合后激活PI3K，同时，Akt 磷酸化后调控下游多种效应分子活化，最终导致PI3K-Akt信号通路被激活活化下游NF-κB，激活的NF-κB 转位进核而产生免疫应答，并诱导多种炎性因子分泌［29］。万应胶囊可能通过抑制PI3K-Akt 信号通路的激活，减少炎性因子的分泌，进而达到治疗上呼吸道感染的效果。除此之外，万应胶囊还具有治疗流感、新型冠状病毒感染及人巨细胞病毒感染等疾病的潜力［30］。综上所述，本研究通过网络药理学与分子对接技术分析万应胶囊治疗上呼吸道感染伴发热的潜在靶点及作用机制，发现万应胶囊治疗急性上呼吸道感染伴发热可能的核心活性化合物是arveninⅠ和6-阿魏酰梓醇，潜在关键靶点为STAT3、HRAS、SRC、PIK3R1、PTPN11，关键信号通路包括HIF-1、AGE-RAGE、PI3KAkt等信号通路。万应胶囊通过多组分、多靶点、多通路协同机制干预疾病分子机制复杂的上呼吸道感染，是临床上治疗上呼吸道感染的重要药物。本研究存在一定的局限性，首先，通过在线数据库检索化合物和靶点，如果数据库更新，可能会对分析结果产生影响。其次，缺乏实验研究验证网络药理学预测的结果，为万应胶囊的应用提供更准确的数据支持。后续将在网络药理学研究的基础上，开展动物及细胞实验验证结果，并根据上市后的反馈对万应胶囊进行再评价。

参考文献：略

推文引用临床药物治疗杂志

来源：

[1] 李佳怡，周晓春，曹俊岭，等. 基于网络药理学和分子对接技术的万应胶囊治疗急性上呼吸道感染伴发热作用机制研究[J]. 临床药物治疗杂志，2023，21（5）：63-69.

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